| CARATTERIZZAZIONE DELLE
MUTAZIONI A CARICO DEI GENI CODIFICANTI PER I FATTORI DELLA COAGULAZIONE |
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Oltre che per la diagnosi, l'identificazione
di mutazioni e lo studio del loro effetto funzionale sono importanti
poiché rappresentano dei modelli che si presentano in
natura e possono fornire informazioni sulla relazione struttura-funzione
dei fattori della coagulazione.
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| Tali studi si svolgono attraverso: |
| 1) Studio
della struttura del cristallo della proteina mutante: |
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- Localizzazione della variazione
trovata nella struttura tridimensionale della proteina per verificarne
l'importanza a livello strutturale e l'influenza sul funzionamento
della proteina stessa |
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- Le coordinate dei cristalli delle proteine
sono ricavate da una Protein Data Bank. La struttura proteica
è visualizzata mediante il programma P INSIGHT II 98.0.
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| 2) Studio
in vitro: |
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- Produzione dei costrutti normali
e mutanti mediante la tecnica della Site Directed Mutagenesis |
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- Produzione della proteina
ricombinante mediante trasfezione transitoria o stabile di tali
costrutti in linee cellulari appropriate con il metodo dell'elettroporazione |
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- Analisi cinetica intra- ed extra-cellulare
della proteina ricombinante mutata con la tecnica dell'immunoprecipitazione
e di pulse-chase labelling usando metionina marcata con S35 per
verificare un eventuale difetto della secrezione della proteina |
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- Immunofluorescenza con anticorpi
specifici |
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- Purificazione della proteina ricombinante
mutata con FPLC o HPLC ed ulteriore caratterizzazione biochimica
della proteina stessa |
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