| CARATTERIZZAZIONE DELLE MUTAZIONI
TROVATE A CARICO DEL GENE DELL'ADAMTS13 |
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Oltre che per la diagnosi, l'identificazione
di mutazioni e lo studio del loro effetto funzionale sono importanti
poiché rappresentano dei modelli che si presentano in
natura e possono fornire informazioni sulla relazione struttura-funzione
della metalloproteasi ADAMTS13.
Tali studi si svolgono attraverso:
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| 1) Predizione dell'effetto
della mutazione all'interno della struttura della proteina mutante: |
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- Localizzazione della variazione trovata
nella struttura tridimensionale della proteina per verificarne
l'importanza a livello strutturale e l'influenza sul funzionamento
della proteina stessa |
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- La struttura proteica è visualizzata
mediante il programma disponibile on line (http://www.aber.ac.uk/compsci/research/biol/dss/prof/
or http://us.expasy.org). |
| 2) Studio in vitro: |
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- Produzione dei costrutti normali e mutanti
mediante la tecnica della Site Directed Mutagenesis |
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- Produzione della proteina ricombinante
mediante trasfezione transitoria o stabile di tali costrutti in
linee cellulari appropriate con il metodo dell'elettroporazione |
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- Analisi cinetica intra- ed extra-cellulare
della proteina ricombinante mutata con la tecnica dell'immunoprecipitazione
e di pulse-chase labelling usando metionina marcata con S35 per
verificare un eventuale difetto della secrezione della proteina |
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- Immunofluorescenza con anticorpi specifici |
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- Purificazione della proteina ricombinante
mutata con FPLC o HPLC ed ulteriore caratterizzazione biochimica
della proteina stessa |
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